RD-Biotech, service de clonage et production d’ADN plasmidique, grade Recherche, High Quality et GMP

Titre 2 de test

Paragraphe 1.

Paragraphe 2.

Phage display

Grâce au savoir-faire de ses sociétés sœurs au sein de l’équipe mAbexperts, RD-Biotech propose le développement d’anticorps recombinants par la technologie de Phage Display :

Phage display chez la souris :

Excellente alternative à la technologie hybridome
Processus rapide (3 à 5 mois)
Fourniture de banques naïves ou immunes (fab, scFv)

Phage display chez le lama :

Développement de vos VHH par immunisation de lamas et grâce à la technologie de phage display.

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Caractérisation et validation des candidats

Spécificité, affinité, bioactivité, …

La plateforme analytique de RD-Biotech offre un large panel de services :

Concentration, Pureté
Détermination du taux d’endotoxines
Détermination du taux d’agrégats
Détermination du taux résiduel de contaminants : protéines A, ….
Séquençage des parties variables VH et VL
Analyse de la spécificité des anticorps recombinants : ELISA, Western Blot, …
Analyse de l’affinité des anticorps recombinants : détermination des Kd, Kon, Koff grâce à la technologie Octet
Analyse de stabilité : DSC
Analyse de l’activité biologique des anticorps : large gamme de bio-essais (ADCC, ADCP, CDC, ….nous consulter) et service de développement à façon

Découvrir les services analytiques

Humanisation

Les anticorps humanisés constituent la majorité des anticorps thérapeutiques approuvés sur le marché.

L’humanisation d’un anticorps parental (par exemple de souris) est réalisée suivant une version modernisée de “CDR-grafting” selon l’approche inventée par Winter et al. (« Medical Research Council » – Cambridge – UK). Le principe de cette méthode consiste à reformater un anticorps humain (séquences germinales) de manière à ce qu’il contienne les régions CDRs (Complementary Determinant Regions) de l’anticorps parental afin de réduire son immunogénicité chez l’homme. L’humanisation par “CDR-grafting” exige que les résidus de l’anticorps de souris impliqués dans la reconnaissance de l’antigène soient préservés dans la version humanisée de l’anticorps.

Suite à l’étape d’humanisation, une optimisation des séquences pourra être proposée avec en option des analyses complémentaires par modélisation moléculaire. L’objectif étant :

L’augmentation de la manufacturabilité (réduction de l’hétérogénéité)
L’augmentation possible de l’affinité et de l’activité biologique (IC50)

La procédure optimisée proposée par RD-Biotech comprend les étapes décrites ci-dessous :

Étape 1 : Humanisation in silico de l'anticorps recombinant

Humanisation par CDR-grafting :

Identification des régions charpentes (FRs) et des CDRs de l’anticorps parental
Recherche et alignement des séquences de l’anticorps parental avec les séquences germinales humaines les plus homologues
Identification des positions critiques
Sélection d’une séquence germinale pour chaque chaîne (VH et VL) basée sur l’analyse de séquence et l’identification des positions critiques
Evaluation de la pertinence de la substitution à chaque position divergente entre les séquences murine et humaine basée sur l’analyse structurale
CDR-grafting par l’analyse des différences de séquence entre les séquences parentales et les séquences acceptatrices de l’anticorps

Optimisation des séquences :

Amélioration de la manufacturabilité de l’anticorps et optimisation de son affinité et activité
Fourniture d’un rapport intermédiaire comprenant la stratégie, les séquences aa des VL et VH de variants humanisés à synthétiser et à tester ainsi que les suggestions d’optimisation de séquences

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Étape 2 : Anticorps recombinant humanisé

Pour chaque construction, les étapes de construction des vecteurs d’expression, co-transfection, production et purification sont réalisées, selon les mêmes procédures que celles décrites dans le chapitre précédent « production par transfection transitoire ».

Les contrôles qualité comprennent :

Contrôle de pureté par électrophorèse en gel SDS-PAGE (conditions réductrices et non réductrices)
Dosage des protéines totales par mesure d’absorbance (spectrophotomètre)
Contrôles supplémentaires proposés (en fonction du projet)
- SEC HPLC
- Détermination de l’affinité
- Tests fonctionnels (plateforme de bioessais)
- Autres tests disponibles, nous contacter

A l’issue de cette étape, un rapport est délivré, comprenant, pour chaque candidat, la stratégie suivie, les résultats obtenus et certificats d’analyses.

Étape 3 : Second cycle d'humanisation et optimisation de séquences

À partir d’un « lead candidat » identifié, un second cycle d’humanisation peut être proposé afin de substituer les éventuels résidus murins par leur homologues humains dans les régions « non CDR » et augmenter ainsi le % humain dans les VH et VL

Optimisation de séquence afin d’éliminer les PTMs potentiels présents dans les CDRs
Analyse complémentaire par modélisation

Ces différentes approches d’optimisation peuvent être menées en parallèle.

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Reformatting d’anticorps

Service de reformatage de vos anticorps en de nombreux formats : scFv, fragments Fab, bispécifiques, changement d’isotypes ou de sous isotypes…

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Séquençage de l’anticorps

RD-Biotech peut prendre en charge le séquençage des chaînes lourdes et légères de l’anticorps monoclonal candidat.

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Chimérisation

La chimérisation constitue un processus simple et direct permettant de conserver l’affinité et la spécificité de l’anticorps parental.

La procédure standard comprend les étapes suivantes :

Développement de l’anticorps monoclonal parental (si demandé)
Séquençage des fragments variables VH et VL de l’anticorps parental (si demandé)
Construction des vecteurs d’expression : optimisation des codons, sélection des domaines constants (espèce et isotype), clonage des domaines variables VH et VL. Contrôles qualité.
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Co-transfection et production des anticorps chimériques par transfection transitoire en cellules CHO
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Evaluation de la productivité par ELISA (kits FastELISA)
Découvrir FastELISA
Purification par chromatographie d’affinité (résine protéine A, G, L…)
Contrôles qualité (services analytiques)
- Contrôle de pureté par électrophorèse en gel SDS-PAGE (conditions réductrices et non réductrices)
- Dosage des protéines totales par mesure d’absorbance (spectrophotomètre)
- Contrôles supplémentaires proposés (en fonction du projet)
  - SEC HPLCo Détermination de l’affinité
  - Tests fonctionnels
  - Autres tests disponibles

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Service d’expression d’anticorps recombinants par transfection transitoire	Prestations prises en charge par RD-BIOTECH
Le client fournit	Séquençage	Séquences nucléiques VH VL	Synthèse clonage	Vecteurs d’expression	Transfection transitoire	Livrables
Anticorps monoclaux						Anticorps recombinants purifiés et contrôlés (pureté >98% et qualité endfree
Séquences VH VL
Vecteurs d’expression

_Modèle fiche service : Production d’anticorps par transfection transitoire

Elle repose sur l’introduction d’un vecteur d’expression codant pour les chaînes lourde et légère dans une lignée cellulaire permettant une expression rapide et à court terme des anticorps recombinants, idéale pour le criblage de candidats ou la production en petite à moyenne échelle.

Elle repose sur l’introduction d’un vecteur d’expression codant pour les chaînes lourde et légère dans une lignée cellulaire permettant une expression rapide et à court terme des anticorps recombinants, idéale pour le criblage de candidats ou la production en petite à moyenne échelle.

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